微生物多样性专题 | 扩增子测序分析实战（一）

微生物多样性专题

（一）

扩增子测序分析实战

前景概要

微生物是地球上出现最早、分布最广、多样性最为丰富的生物类群。其微小的个体和长期的进化，使它们形成了极丰富的多样性，并具有巨大的生物总量。17世纪显微镜的发明与之后的微生物分离培养方法，使人们真正意义上开始对微生物进行研究，然而传统分离培养的方法只能实现对不到1%的微生物进行分离培养，这就极大地限制了人们对微生物多样性的认识。随着高通量测序和生物信息学等技术的发展，为进一步研究微生物多样性提供了新的途径和技术手段。

扩增子测序是对特定长度的PCR产物或者捕获的片段进行测序，主要包括16S rRNA测序（细菌）、18S rRNA测序（真核）、ITS测序（真菌）、功能基因等目标区域。

基于第二代高通量测序平台测定的16S/18S/ITS高变区域的序列，来反应环境样品在细菌、真菌、古菌分类方面物种之间的差异，对研究海洋、土壤、肠道粪便等环境中的微生物构成有重要的指导作用。    

以细菌16S rRNA片段的研究为例，我们从下图中可以看到测序技术在微生物多样性中的发展史:

测序技术微生物发展史

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为什么会是16S?

16S rRNA，是原核核糖体30S小亚基的组成部分。"S"是沉降系数，反映生物大分子在离心场中向下沉降速度，值越高，说明分子越大。

原核生物的rRNA按沉降系数分为23S、16S、5SrRNA，它们分别含有2,900、1540和120个核苷酸，5SrRNA基因序列较短，包含的遗传信息较少，不适于细菌种类的分析鉴定；23SrRNA基因的序列太长，且其碱基的突变率较高，不适于鉴定亲缘关系较远的细菌种类；16SrRNA普遍存在于原核细胞中，且含量较高、拷贝数较多（占细菌RNA总量的80%以上），便于获取模板，功能同源性高，遗传信息量适中，适于作为细菌多样性分析的标准。

16S rRNA gene是细菌分类学研究中最常用的"分子钟"，1540bp的序列长度中包含9个可变区（Variable region）和10个保守区（Constant region）。可变区因菌种不同而异，且变异程度与细菌的系统发育密切相关。通过检测16SrRNA可变区的序列变异和丰度，可了解环境样品中群落多样性信息，在微生物分类鉴定、微生态研究等方面起着重要的作用。

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扩增区域该如何选择？

V3-V4、V4-V5区特异性好，数据库信息全，是细菌多样性分析注释的最佳选择。

肠道微生物推荐V3-V4/V4；土壤/海水等环境微生物推荐V4-V5区。

较单V区测序分析，双V区的优势在于提高种属分类的准确性，能获得更多的参考序列。

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其他扩增子区域？

ITS（Internal Transcribed Spacer,内转录间隔区）测序主要是针对真菌多样性的研究，注释准确度高；18S测序针对的是真核微生物，注释到的范围广，但是就真菌来说精确度相对较低；

ITS分为两个区域：ITS1/ITS2，其中ITS1位于真核生物核糖体rDNA序列18S和5.8S之间，ITS2位于真核生物核糖体rDNA序列5.8S和28S之间；核糖体DNA中的18S、5.8S和28S的基因组序列在大多数生物中趋于保守，在生物种间变化小，而内转录间隔区ITS1和ITS2作为非编码区，承受的选择压力较小，相对变化较大，常用于真菌分类鉴定。